Izolarea clonei
În general, donarea se face pentru a obține clona unei gene particulare sau a unei secvențe de ADN de interes. Prin urmare, următorul pas după clonare este găsirea și izolarea acelei clone printre ceilalți membri ai bibliotecii. Dacă biblioteca cuprinde întregul genom al unui organism, atunci undeva în acea bibliotecă va fi clona dorită. Există mai multe moduri de găsire, în funcție de gena specifică în cauză. Cel mai frecvent, un segment ADN clonat care arată omologia genei căutate este utilizat ca sondă. De exemplu, dacă o genă de șoarece a fost deja clonată, acea clonă poate fi folosită pentru a găsi clona umană echivalentă dintr-o bibliotecă genomică umană. Coloniile bacteriene care constituie o bibliotecă sunt cultivate într-o colecție de preparate Petri. Apoi, o membrană poroasă este așezată pe suprafața fiecărei plăci și celulele aderă la membrană. Celulele sunt rupte, iar ADN-ul este separat în catene unice - toate pe membrană. Sonda este, de asemenea, separată în cabluri unice și etichetată, adesea cu fosfor radioactiv. O soluție a sondei radioactive este apoi utilizată pentru scăldarea membranei. ADN-ul sondei monocatenare va adera numai la ADN-ul clonei care conține gena echivalentă. Membrana este uscată și plasată pe o foaie de film sensibil la radiații, iar undeva pe filme va apărea o pată neagră, anunțând prezența și locația clonei dorite. Clona poate fi apoi preluată din vasele originale Petri.
genetică: tehnologie ADN recombinantă și reacția în lanț a polimerazei
Progresele tehnice au jucat un rol important în avansarea înțelegerii genetice. În 1970, microbiologii americani Daniel Nathans
Secvențiere ADN
Odată ce un segment de ADN a fost clonat, secvența de nucleotide poate fi determinată. Secvența de nucleotide este cel mai fundamental nivel de cunoaștere a unei gene sau a unui genom. Modelul este cel care conține instrucțiunile pentru construirea unui organism și nicio înțelegere a funcției sau evoluției genetice nu ar putea fi completă fără a obține aceste informații.
utilizări
Cunoașterea secvenței unui segment ADN are multe utilizări, iar unele exemple urmează. În primul rând, poate fi folosit pentru a găsi gene, segmente de ADN care codifică o proteină specifică sau un fenotip. Dacă o regiune de ADN a fost secvențiată, acesta poate fi ecranizat pentru caracteristicile caracteristice ale genelor. De exemplu, cadrele de citire deschise (ORF) - secvențe lungi care încep cu un codon de început (trei nucleotide adiacente; secvența unui codon dictează producția de aminoacizi) și sunt neîntrerupte de codonii de oprire (cu excepția unuia la terminarea lor) - sugerează un regiunea care codifică proteinele. De asemenea, genele umane sunt în general adiacente așa-numitelor insule CpG - grupuri de citosină și guanină, două dintre nucleotidele care alcătuiesc ADN-ul. Dacă se cunoaște că o genă cu un fenotip cunoscut (cum ar fi o genă a bolii la om) se află în regiunea cromozomială secvențiată, atunci genele neasignate din regiune vor deveni candidați pentru această funcție. În al doilea rând, secvențele de ADN omologe ale diferitelor organisme pot fi comparate pentru a relaționa relații evolutive atât în interiorul cât și între specii. În al treilea rând, o secvență de gene poate fi ecranizată pentru regiunile funcționale. Pentru a determina funcția unei gene, pot fi identificate diverse domenii care sunt comune pentru proteine cu o funcție similară. De exemplu, anumite secvențe de aminoacizi din cadrul unei gene se găsesc întotdeauna în proteine care acoperă o membrană celulară; astfel de întinderi de aminoacizi sunt numite domenii transmembranare. Dacă un domeniu transmembranar se găsește într-o genă cu funcție necunoscută, sugerează că proteina codificată este localizată în membrana celulară. Alte domenii caracterizează proteinele care leagă ADN-ul. Mai multe baze de date publice cu secvențe ADN sunt disponibile pentru analiză de către orice persoană interesată.
